動物腹腔鏡技術在牛體外受精中卵母細胞的收集（活體采卵）上的應用

腹腔鏡技術采取卵母細胞的回收率與直接從卵巢采卵相比操作簡便，此外還可通過腹腔鏡進行卵泡發育情況的檢查。

操作方法：

腹腔鏡的插入：將鈍頭套針插入套管，把套管插入陰道，通過直腸把握將套管前端定位于陰道穹隆預定部位，然后撤出鈍頭套針，插入棱錐套針，并調整角度。使套針的方向與牛的長軸略向右呈10°的夾角，向上用力穿透陰道穹隆。如阻力突然減少，則表明已經刺穿陰道穹隆，此時取出套針，當聽見有空氣進入的聲音且直腸把握的手同時感到腹腔的膨脹，則表明刺入的位置正確，即可將消毒后的帶有內窺鏡筒的不銹鋼鞘插入套管中去。根據直腸把握的感覺，若感到腔較小，則需充入一些CO2，進氣的速度一般應控制在,7~L/min,充入的氣體的多少因牛只的大小而定"一般為9L左右。

卵母細胞的采集：直腸把握操作者應不斷地調整腹腔鏡與卵巢的位置，展示卵巢上不同位置卵泡及黃體的形態，以便確定需要穿刺的卵泡。一名助手根據直腸把握操作者的口令和屏幕上顯示的卵泡，操作穿刺針，采集卵泡液，將卵泡液放入事先加入少量培養液的收集管中。另一名助手負責操作腳踏真空泵，為了防止卵母細胞的流失，真空泵的啟動（負壓應在100mm汞柱)應先于穿刺。收集后卵泡液靜置于試管架5~10min后，用吸管吸取收集管底部的卵泡液到平皿中，然后在光學顯微鏡下觀察。并將檢出的卵母細胞吸入到細管中。封閉好細管的兩端，卵母細胞即可運輸到實驗室進行成熟培養。操作完成后，將內窺鏡鏡筒取出，由兩名助手按壓母牛兩側腹壁排出腹腔內氣體，到氣體不再排出為止，再取出套管，隔日進行陰道檢查，防止出現感染。

注意事項：

1、麻醉方面：不可過淺或過深。有效的麻醉是完成卵泡穿刺獲取卵母細胞的先決條件。 麻醉過淺，牛有痛感，在操作時不安、掙扎，會影響操作的準確性，要補充麻醉。 麻醉過深，牛只站立不穩，甚至臥下，也影響操作。如牛只臥下，應立即停止操作，迅速撤出套管和腹腔鏡筒，同時還應注意及時解除保定，避免牛只的受傷。

2、穿刺方面：直腸把握者在穿刺陰道穹隆時應正確把握刺入角度，防止刺穿直腸和大腸。在穿刺卵泡時，針頭不宜刺的過深，否則會傷及卵巢實質，造成出血，這不僅會污染卵泡液，影響卵母細胞的檢出，堵塞針頭和導管，而且還會影響卵巢上卵泡的恢復。 如遇出血，應立即停止卵泡穿刺，更換針頭和導管及采集管，并用0.01mg肝素/ML生理鹽水沖洗針頭及導管，方可進行下一個卵泡穿刺。

3、采集卵泡液方面：采集的卵泡液應盡量保持恒溫，最好采集后立即檢出卵母細胞，并放入含有FSH的成熟培養液內，包裝在細管中運送至實驗室，一般從采出到放入培養箱進行成熟培養的時間不宜超過4h。

4、技能方面：成功地運用此方法，不僅需要良好的設備，還要求操作者具有較高的知識水平及熟練的實際操作能力，同時還需要與兩名助手密切配合。因此，在實驗操作前必須要進行必要的培訓。

另外，還可以通過此方法從青年母牛體內提早獲取卵母細胞，從而提高母牛的利用期限和繁殖潛力，加速遺傳進展。該方法將是繼超數排卵和離體卵巢的利用技術之后的有一獲取卵源的好方法。

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